Как нагреватели из ПТФЭ используются в синтезе пептидов и производстве олигонуклеотидов?

Циклы синтеза пептидов и олигонуклеотидов завершаются стадией расщепления, на которой полученный продукт отделяется от смолы с помощью трифторуксусной кислоты (ТФУ) или других сильных кислот. Для эффективного расщепления эту коррозионную смесь необходимо нагреть, а для этого требуется нагреватель, способный выдерживать воздействие кислоты и не загрязнять высокие-результаты. Требования к чистоте терапевтических пептидов и синтетических олигонуклеотидов чрезвычайно высоки, и выбор нагревательного оборудования становится важным технологическим аспектом.

Этап расщепления и снятия защиты при твердофазном синтезе
Целевая молекула собирается на нерастворимой смоляной подложке посредством твердофазного пептидного синтеза (SPPS) и твердофазного синтеза олигонуклеотидов. Вся последовательность собирается, а затем результат необходимо отколоть от смолы. В то же время удаляются защитные группы боковой цепи (для пептидов) или лабильные защитные группы оснований/кислот (для олигонуклеотидов).

Обычным коктейлем расщепления для синтеза пептидов является трифторуксусная кислота (ТФУ) в качестве основного агента расщепления, часто в сочетании с поглотителями, такими как триизопропилсилан (ТИС), вода или 1,2-этандитиол (ЭДТ). Для синтеза олигонуклеотидов снятие защиты можно провести с использованием концентрированного водного раствора аммиака или, в некоторых ультрамягких методах, с помощью растворов, содержащих ТФУ.

часто процесс расщепления проводят при повышенной температуре, часто от 30 до 60 градусов, чтобы обеспечить полное высвобождение продукта в течение приемлемого времени (1–4 часа). Более высокие температуры ускоряют расщепление и снятие защиты, но они также повышают вероятность ухудшения качества продукта, если его не контролировать должным образом. Нагрев должен быть однородным, воспроизводимым и свободным от каких-либо загрязнений.

Решения, содержащие TFA- – коррозионная проблема
Трифторуксусная кислота (pKa ~ 0,23) — мощная органическая кислота, способная растворять многие металлы и повреждать типичные инженерные полимеры. Пары ТФУ также очень агрессивны при высокой температуре. Металлические погружные нагреватели (титан, нержавеющая сталь 316L или хастеллой) могут вызвать точечную, межкристаллитную коррозию или шероховатость поверхности после воздействия горячего ТФУ в течение нескольких циклов расщепления.

Коррозия может привести к попаданию в раствор скола ионов металлов (железа, хрома, никеля, титана и т. д.). Эти ионы металлов могут образовывать комплексы с пептидным или олигонуклеотидным продуктом, что приводит к:

Снижение чистоты, измеренное с помощью ВЭЖХ или ЖХ-МС.

Биологическая активность, которая непредсказуема

Примеси металлов, которые трудно устранить в лиофилизированном конечном продукте

Более того, ионы металлов могут катализировать побочные процессы, такие как окисление остатков метионина или триптофана в пептидах или депуринирование в олигонуклеотидах. Такое загрязнение не допускается для фармацевтических субстанций класса GMP.

Как нагреватели из ПТФЭ решают проблему нагревания при расщеплении
Для этого требовательного применения предназначены погружные нагреватели из политетрафторэтилена (ПТФЭ), поскольку ПТФЭ полностью устойчив к трифторуксусной кислоте даже при повышенных температурах. Сотни циклов расщепления не приводят к химическому воздействию, набуханию или деградации поверхности. Конструкция олигонуклеотида для синтеза пептидов с нагревателем из ПТФЭ представляет собой чистый, инертный источник тепла непосредственно в сосуде для расщепления или в резервуаре предварительного-нагревания для коктейля TFA.

Полная устойчивость к TFA и мусорщикам
ПТФЭ стабилен по отношению к TFA, TIS, EDT, фенолу, тиоанизолу и другим компонентам стандартной смеси расщепления. Такая же химическая инертность наблюдается и для средств снятия защиты с олигонуклеотидов, таких как концентрированный аммиак или метиламин. Погружной нагреватель из ПТФЭ можно погружать непосредственно в раствор для расщепления без какой-либо коррозии или выщелачивания ионов.

Не-поверхность, не допускающая образования остатков-вверх
Гладкая, не-поверхность ПТФЭ также устойчива к накоплению остатков пептидов или олигонуклеотидов, фрагментов расщепленной смолы или побочных продуктов-поглотителей. Промыть прилипший материал растворителями, такими как дихлорметан, ацетонитрил или вода, легко. Это упрощает очистку, предотвращает перекрестное-загрязнение различных партий синтеза и упрощает проверку производства по стандартам GMP.

Точный контроль температуры для максимального выхода
Погружной нагреватель из ПТФЭ обычно связан с ПИД-регулятором и датчиком температуры (PT100 или термопарой), непосредственно касающимся раствора для расщепления. Низкая тепловая масса оболочки из ПТФЭ позволяет быстро реагировать на изменения заданных значений. Типичный профиль нагревания расщепления может быть следующим:

Изменение температуры окружающей среды до 40 градусов (более 10 минут)

Удерживайте температуру 40 градусов ± 0,5 градуса в течение 90 минут.

затем охлаждают до 25 градусов, продукт осаждают и фильтруют.

Такой точный контроль гарантирует максимальный выход продукта и в то же время предотвращает побочные реакции, такие как образование аспартимида в пептидах или расщепление фосфодиэфирных связей в олигонуклеотидах.

Рекомендации по применению: Выбор размера ПТФЭ-нагревателя для обычных объемов спайности
Примечание по применению: Для синтеза пептидов в лабораторном масштабе (загрузка смолы от 0,1 до 10 ммоль) количество расщепляемого вещества обычно составляет от 5 до 500 мл. Подходящим является погружной нагреватель из ПТФЭ мощностью от 50 до 200 Вт. Плотность мощности нагревателя должна поддерживаться низкой (менее или равной 10 Вт/см^2), чтобы предотвратить локальное кипение ТФУ (точка кипения ~72 градуса). Автоматизированные синтезаторы или пилотные реакторы-масштаба (объем расщепления 1-50 л) могут быть оснащены многочисленными ПТФЭ-нагревателями или одним более крупным нагревателем (500-3000 Вт). Геометрию нагревателя (прямой, L-образный или змеевик) следует выбирать так, чтобы он помещался в сосуд для расщепления, не мешая магнитному перемешиванию или перемешиванию сверху.

В автоматических синтезаторах нагреватели из ПТФЭ обычно включаются в модуль расщепления в качестве предварительного-нагревателя потока реагентов ТФУ. Прежде чем достичь реакционного сосуда, кислота проходит через крошечный встроенный в линию нагреватель из ПТФЭ-. Это гарантирует, что смесь для расщепления достигнет заданной температуры сразу же после попадания на смолу.

Чистота конечного продукта зависит от загрязнения.-Свободный нагрев
Чистыми должны быть все части, которые соприкасаются с раствором для расщепления, чтобы конечный результат оставался чистым. Система олигонуклеотидов для синтеза пептидов с нагревателем из ПТФЭ гарантирует отсутствие попадания ионов металлов, экстрагируемых веществ или частиц во время необходимого процесса снятия защиты и расщепления. Это особенно важно для терапевтических пептидов и олигонуклеотидов, предназначенных для использования человеком, для которых фармакопеи (например, USP<232>, ICH Q3D) устанавливают высокие пороговые значения для элементарных примесей.

Заключение: ведущее передовое биофармацевтическое производство
Нагреватели из ПТФЭ являются жизненно важным компонентом на заключительном, критическом этапе производства пептидов и олигонуклеотидов, обеспечивая выход и чистоту. Нагреватели представляют собой химически инертный, незагрязняющий и точно регулируемый источник тепла в присутствии горячей ТФУ и других агрессивных расщепляющих агентов, что позволяет химику-синтетику оптимизировать условия расщепления, не жертвуя качеством результата.

Передовому биофармацевтическому производству необходимы решения для нагрева-высокой чистоты. Растущий спрос на синтетические пептиды (например, агонисты GLP-1) и терапевтические олигонуклеотиды (например, антисмысловые препараты и препараты миРНК) будет способствовать использованию погружных нагревателей из ПТФЭ для стадий расщепления и снятия защиты в качестве обычной практики в исследовательских и производственных условиях GMP.